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flash 트러블이 있어 카카오TV영상으로 다시 올립니다.

<중딩, 생명과학을 논문으로 만나다.>

The article I'll be explaining is "Single master regulatory gene coordinates the evolution and development of butterfly color and iridescence". This article was shared by prof. Robert D. Reed and his team. Scientists used to think that multiple genes were responsible for the wing color and patterns of butterflies by interacting with each other. The article itself states that dozens of genes were implicated in wing pattern development as well. But researches showed that only a few genes owned the role of actual, effective causation of the difference in wing color and patterns. The optix gene was one of them. However, the actual developmental function of optix was unclear. This article shows that the optix gene is responsible for the determination of chromatic coloration by repression of melanins and promotion of ommochromes, iridescence and wing scale structure in nymphalid butterflies (Also known as "four - footed butterflies"). The team used the CRISPR - cas9 technology to drive targeted deletion of the optix gene in four species of the Nymphalidae.

 제가 이번에 설명할 논문은 "Single master regulatory gene coordinates the evolution and development of butterfly color and iridescence" 입니다. 이 논문은 로버트 리드 박사님과 그의 연구팀이 작성했습니다.

  과학자들은 나비들의 날개 색과 무늬들을 결정하는 유전자들은 많으며, 그들이 만들어내는 형질들이 섞여져서 색과 무늬들이 나온다고 생각했었습니다. 논문 자체에서도 여러 유전자들이 날개 무늬와 관련 있음을 알려줍니다. 하지만 연구 결과, 몇몇개의 유전자들만이 실제로 나비 날개의 색 및 무늬 차이의 효과가 크게 나타나게 함을 알게되었습니다. optix (옵틱스) 유전자가 그들 중 하나입니다. 그러나, 옵틱스의 실질적인 기능은 불확실했습니다. 이 논문은 옵틱스 유전자가 멜라닌 억제 및 오모크롬 촉진으로 네발나비과 나비들의 날개 비늘 구조, 날개 색 및 무지개빛 (방향적 구조색)의 결정을 책임짐을 보여줍니다. 팀은 크리스퍼 - 카스9 기술을 이용해 4 종의 네발나비과 나비들의 옵틱스 유전자를 삭제했습니다.

 The nymphalids are -

 이 글에 나오는 네발나비과 나비들은 - 

• H. erato
• A. vanillae
• V. cardui
• J. coenia

Next, I'll explain some difficult terms.

 다음으로, 어려운 단어들을 해설하겠습니다.

• Structural coloration: Production of color by microscopically structured surfaces that interfere with light.
• 구조색: 빛을 간섭하는 마이크로 구조들에 의해 생기는 색.
• Iridescence: A phenomenon where surfaces change color depending on the angle of view.
• 방향적 구조색 (흔히 무지개빛이라고 한다): 보는 방향과 각도에 따라 표면의 색이 달라지는 현상.
• Ommochrome: Biological pigments that occur in the eyes of crustaceans and insects. They have a wide range of colors. In this case, the ommochrome is responsible for the red, orange and brown colors of the butterflies' wings.
• 오모크롬: 갑각류와 곤충들의 눈에 존재하는 색소로, 넓은 범위의 색을 가지고 있다. 이 경우에는, 나비들의 날개의 빨간색, 주황색, 갈색 색들을 만드는 역할을 한다.
• Melanin: Biological pigments that are responsible for the dark color (In this case, usually gray and black) of organisms.
• 멜라닌: 생물체들의 어두운 색 (이 경우에는, 회색과 검은색을 담당한다)을 만드는 색소다.
• Mosaic: An organism that has two or more populations of cells with different genotypes because of error during mitosis. Mosaics originates from one zygote, which makes them differ from Chimeras (Chimeras originate from multiple zygotes).
• 모자이크: 수정란이 세포 분열 중 오류로 인해 서로 다른 유전자형을 가진 둘 이상의 세포 집단을 가지게 되는 생물체로, 하나의 수정란에서 시작했기 때문에 둘 이상의 수정란이 혼합된 키메라들과 구분된다.
• Dorsal: The upper surface of the wing/body of an organism.
• Dorsal: 생물체의 등쪽, 날개 위쪽을 뜻하는 단어다.
• Ventral: The bottom surface of the wing/body of an organism.
• Ventral: 생물체의 배쪽, 날개 아래쪽을 뜻하는 단어다.
• Basal area: The area near the base of the wings.
• Basal area (기저 구역): 날개가 몸 (머리, 가슴, 배 통틀음)과 가장 가까운 곳 주위 구역.
• Discal area: The area next to the basal area. You can think of it being the 2/3 part of each wing.
• Discal area: Basal area 옆 구역으로, 각 날개를 3등분 했을 때, 중간에 해당하는 구역이다. 

Let's talk about H. erato first.

 H. erato에 대해 먼저 말하겠습니다.

  You can see that the red ommochrome has changed into black melanin.

  빨간색 오모크롬이 검은색 멜라닌으로 바뀌었음을 볼 수 있습니다.

  B shows the obvious color difference between the wild type (Abbreviated as "WT") and the mutant wing patterns. C, C’, C” shows the difference in wing scale morphology (Shape) and color. Each one is the zoomed in version of the previous one. C” shows that the WT wing scale has a pointed structure, while the mutant wing scale has the normal, relatively roundish structure. As mentioned in the article itself, the results showed that the optix gene acts as an "or" switch between ommochrome and melanin.

 B는 야생형 ("WT"로 줄여 표기)과 돌연변이 날개 무늬들의 분명한 색 차이를 보여줍니다. C, C’, C”은 그들의 날개 비늘 모양과 색의 차이를 점점 확대해 보여줍니다. 여기서 C”은 WT 날개 비늘은 뾰족한 모양이며, 돌연변이 비늘은 상대적으로 둥글둥글한, 일반적인 모양을 가짐을 보여줍니다. 논문 자체에서도 말했듯이, 결과들이 옵틱스 유전자가 오모크롬과 멜라닌 사이에 작용하는 "또는" 스위치 역할을 함을 보여주었습니다.

Second is A. vanillae.

두번째는 A. vanillae 입니다.

   Both dorsal and ventral wings show that the orange and brown ommochrome wing scales have turned into black and silver melanin wing scales. The green arrows on the ventral mutant wing show the WT wing scales that turned into silver patches. This was called the "presumptive clone boundaries". I assume it was called that way because the wing scales outside the "clone boundaries" have its while spots unchanged and has minor change in overall wing color (Dark gold-ish forewing top part and hindwing → Light brownish & black forewing top part and black hindwing).

 등쪽과 배쪽 날개에 있는 주황색, 갈색 오모크롬 날개 비늘들이 검은색과 은색 멜라닌을 가진 날개 비늘로 바뀜을 보여줍니다. 돌연변이 나비의 배쪽 날개에 있는 초록색 화살표는 은색으로 변한 야생형 날개 비늘들을 보여줍니다. 이들은 "추정적 클론 경계"라 불렸습니다. 아마 돌연변이의 "클론 경계" 바깥의 날개 비늘들의 하얀색 점들은 바뀌지 않았으며, 전체적인 날개의 색은 변화가 거의 일어나지 않았기 때문으로 저는 생각합니다 (앞날개의 위쪽 어두운 금색 부분과 하얀색 점들을 제외한 뒷날개 전체 → 앞날개의 위쪽은 연한 갈색 & 검은색으로 변하고 뒷날개는 하얀색 점들을 제외하고 검은색이 되었음).

  E shows the zoomed in detail of the knockout clone boundary and the switch of colors between red (WT) and black (Mutant) in the ventral forewing. F was a very interesting picture to see. Some of you reading this might've noticed the three black spots relatively darker than the overall black color of the wing by deletion of the optix gene of the mutant A. vanillae in the first picture that shows A. vanillae. Your eyes weren't wrong. The spots are darker than the usual "black" of the mutant A. vanillae wing. F shows the black spots with white arrows. Also, the black spots can be clearly seen on the ventral wing of the WT A. vanillae. The phenotypic trait of the WT A. vanillae wing didn't change in the case of the mutant A. vanillae wing.

  Here's one more interesting fact: The parts of the A. vanillae wing that didn't change after optix gene knockout are all from the ventral wing. I assume these unchanged patterns are controlled by factors other than the optix gene. G and G’ shows the WT and mutant wing scale morphology from pointed to normal and the color change between WT and the mutant wing scale.

  E는 배쪽 앞날개에 있는 클론 경계를 확대한 모습을 보여주며, 이에서 빨간색 (야생형)에서 검은색 (돌연변이)로 색이 바뀜을 알 수 있습니다. F는 매우 흥미로운 사진이이었습니다. 아마 이 글을 보시는 독자 여러분 중 몇분께서는 A. vanillae를 처음으로 보여주는 사진에서 optix 유전자의 삭제에 의한 돌연변이 A. vanillae의 검은색 배쪽 날개보다 더 어두운 3개의 검은색 점들을 보신 분들도 계실겁니다. 잘못 본 것이 아닙니다. 그 점들은 진짜로 돌연변이 A. vanillae의 검은색 배쪽 날개보다 더 어둡습니다. F에서는 그 점들을 하얀색 화살표로 표시했습니다. 또한, 그 검은 점들은 야생형 A. vanillae의 배쪽 날개에서 눈에 띄게 보입니다. 야생형 A. vanillae 날개의 표현형 형질이 돌연변이의 경우에서도 바뀌지 않은 것입니다.

  흥미로운 점을 또 한가지 더 쓰겠습니다: A. vanillae의 optix 유전자가 삭제된 뒤에도 바뀌지 않은 부분들은 모두 배쪽 날개에 있다는 겁니다. 저는 이러한 변화가 없는 부분들은 optix 유전자 이외의 다른 인자들에 의해 조종되기 때문으로 예상합니다. G와 G’은 날개 비늘의 모양이 뾰족한 모양 (야생형)에서 둥근 일반적인 모양 (돌연변이)로 변화된 모습과 야생형과 돌연변이 날개 비늘의 색 변화를 보여줍니다.

Third is V. cardui.

세번째는 V. cardui 입니다.

  There is a pretty noticeable difference in the mutant ventral wing compared to the previous two butterflies. We can see that the orange part of the WT ventral wing lost its color, meaning the loss of ommochrome has happened as usual. But unlike previous butterflies, hypermelanization (Formation of dark colors in an organism by increased concentration of melanin) was very low. This produced a mutant ventral wing with widespread white colors shown in the picture above.

  돌연변이 나비의 배쪽 날개는 이전 나비들과 다른 특이점을 보여줍니다. 야생형 나비의 배쪽 날개의 주황색 부분들은 색을 잃었으므로, 늘 그랬듯이 오모크롬이 감소/사라졌음을 보여줍니다. 하지만 이전 나비들과 다르게 과멜라닌화 현상 (멜라닌 색소의 농도가 높아짐으로서 생물체한테서 어두운 색이 보이는 현상) 은 매우 적게 나타났습니다. 이는 위 사진과 같이 하얀색이 주로 퍼져있는 돌연변이 배쪽 날개를 만들게 되었습니다.

  B shows melanization of the red/orange parts of the mutant butterflies. C and D shows the phenomenon of loss of ommochrome and low hypermelanization in the ventral forewing and hindwing, respectively.

  B는 돌연변이 나비들의 빨간색/주황색 부분들이 멜라닌화되는 모습을 보여줍니다. C와 D는 배쪽 날개의 앞, 뒷날개의 오모크롬의 감소와 과멜라닌화 현상이 나타나지 않는 모습을 보여줍니다.

  The low hypermelanization didn't happen to all V. cardui butterflies. The team was able to recover late stage pupal V. cardui wings that died before emergence. As shown in the picture above, the mutant late stage pupal ventral V. cardui wings showed hypermelanization in locations where the red ommochromes used to be. The team speculated that this variable strength of ventral wing pattern melanization reflected a dosage effect (The alteration of a phenotype by an increased dosage/amount of the product of a gene), where the phenotypes with stronger melanization representing biallelicoptix deletion clones. However, there's no direct evidence to support the speculation. So the reason for the causation of this phenomenon is yet unknown.

  하지만, 모든 V. cardui 나비들한테서 과멜라닌화 현상이 나타나지 않은 것은 아닙니다. 연구팀은 번데기 말기 시기에 죽은 V. cardui 의 날개를 얻는데에 성공했으며, 위 사진에서 보이듯이, 돌연변이 번데기 말기 시기 V. cardui 는 빨간색 오모크롬이 있던 자리에 과멜라닌화 현상이 나타났습니다. 연구팀은 이러한 배쪽 날개 무늬의 멜라닌화 정도의 차이가 유전자량 효과 (어떤 특정 유전자의 생성물의 양이 증가함으로서 표현형이 변화하는 효과) 를 나타내며, 멜라닌화 현상이 더 강하게 나타난 생물체들은 두 대립 형질 모두 돌연변이가 생겼다고 추측했습니다. 그러나, 이 추측을 뒷받침할만한 증거는 없기 때문에 이 현상이 나타나는 이유는 아직 미확인 상태입니다.

  F shows the conversion of scale morphology from pointed (WT) to normal (Mutant).

  F는 날개 비늘 모양이 뾰족한 모양 (야생형)에서 둥근, 일반적인 모양 (돌연변이)으로 변하는 모습을 보여줍니다.

Fourth is J. coenia.

네번째는 J. coenia 입니다.

  The mutant wings of J. coenia has something unique compared to the previous three. It is structural iridescence. The wings on the very right of picture A are additional phenotypes of mutant J. coenia butterflies. As described in both pictures above, you can see strong, bluish iridescence on the dorsal discal spot and eyespot ring. The ventral wing has less iridescence compared to the dorsal wing. Instead, the ventral wing usually showed melanization of the orange patterns. Heavily "already melanized" WT patterns like the black tips of the forewing didn't go under iridescence.

  돌연변이 J. coenia의 날개들은 이전 나비들과는 다른 특징을 보여줍니다. 눈에 띄는 푸른 방향적 구조색입니다. 사진 A의 맨 오른쪽에 있는 날개들은 돌연변이 J. coenia 나비들의 날개들의 추가적인 표현형을 보여줍니다. 위 두 사진에서 보이듯이, 돌연변이 나비의 등쪽 날개의 2/3 부분과 "눈알" 모양 주변 고리의 구조색이 변형되어 푸른색을 띰을 볼 수 있습니다. 배쪽 날개는 등쪽 날개에 비해 구조색이 덜 변형되었습니다. 그 대신에 배쪽 날개는 주황색 무늬들의 멜라닌화가 주로 일어났습니다. 앞날개의 검은 부분들과 같이 "이미 강하게 멜라닌화된" 야생형 나비의 날개 무늬들은 구조색이 푸른색으로 바뀌지 않았습니다.

  C shows the mutant ventral J. coenia wing shown in the white dotted box in A. As you can see, the orange patterns in the WT ventral wing has undergone melanization.

  C는 A에서 돌연변이 J. coenia의 배쪽 날개에 하얀색 점선으로 이루어진 공간에 보여진 부분을 확대해 보여주었습니다. 야생형 나비의 배쪽 날개에 있던 주황색 무늬들이 멜라닌화되었음을 볼 수 있습니다.

  D shows detail of the iridescence on the ventral hindwing. The "bluish" parts are the parts that has iridescence.

  D는 배쪽 뒷날개에 일어난 구조색의 변형을 확대해 보여줍니다. "푸른" 부분들이 다 구조색이 변형된 부분들입니다.

  E shows the variations of the patterns in dorsal forewings. The left one shows iridescence while the right one shows melanization.

  E는 등쪽 앞날개에 있는 무늬들의 종류를 보여줍니다. 왼쪽은 구조색이 바뀌어 푸른색을 띄고 오른쪽은 무늬들이 멜라닌화되었음을 보여줍니다.

  F shows the difference in morphology of the wing scales between WT and the mutant. The results in J. coenia showed that the optix gene acts as a repressor of structural iridescence in this species.

  F는 야생형과 돌연변이 나비들의 날개 비늘 모양의 차이를 보여줍니다. J. coenia에서 나온 결과들은 optix 유전자가 이 종의 나비들의 날개 비늘의 구조색 변형을 억제하는 기능을 가짐을 보여주었습니다.

  The results from the four nymphalids showed that the optix gene acts as an "or" switch between ommochrome and melanin. But as seen in V. cardui, it may act as an "and" switch in some cases. The optix gene also has an influence to the structure of the wing scales by making them from pointed to normal, round scales.

  4 종의 네발나비과 나비들에서 나온 결과들은 optix 유전자가 오모크롬과 멜라닌 사이에 "또는" 스위치의 역할을 가짐을 보여주었습니다. 하지만 V. cardui 에서 봤듯이, 어떤 경우에는 "그리고" 스위치의 역할을 가지기도 합니다. 또한, optix 유전자는 날개 비늘의 모양을 뾰족한 모양에서 둥근 모양으로 바꿔 날개 비늘 모양/구조에 영향을 줍니다.

  If you look at the bottom wing set of picture A in the case of J. coenia, you'll see that I crossed out the "dorsal" part and fixed it to "ventral". When I was reading the article, I saw picture A having two wing sets both being dorsal wings. I had a bit of suspicion since the previous ones showed both dorsal and ventral wings together. Further reading made me conclude that the second set of wings are ventral. I sent an email to prof. Robert D. Reed and asked him for clarifications.

  J. coenia 의 경우의 사진 A를 보면 제가 "dorsal" (등쪽) 이라 쓴 부분을 "ventral" (배쪽) 이라 고쳐썼음을 볼 수 있을 겁니다. 제가 이 논문을 읽고 있었을 때, 사진 A가 등쪽 날개 두 그룹을 가지고 있음을 보여주었습니다. 이전 나비들은 등쪽과 배쪽 날개 모두 보여주었기 때문에 저는 이에 대해 의심이 들었습니다. 계속 읽어본 결과, 저는 두번째/아래 날개 그룹은 배쪽 날개임을 확신했습니다. 그 뒤, Robert D. Reed 박사님께 이메일을 보내 이에 대해 여쭈어봤습니다.

Here is the email:

  A few days later, he replied to me:

  I was very happy that he read and replied to my email. The reply email confirmed the error and therefore letting me fix the picture's annotation.

I wish this article helped students understand and learn biology better.

<11/17, 2017>

Haein Kim (김해인)

Credits:

• The article
• News from nature about this article

Additional sites that helped me understand scientific terms used in the article:

• Butterfly term explanation
• About iridescence
• About melanins
• About ommochromes
• About mosaics
• About the Nymphalidae
• About the dosage effect

 <동영상이 포함 된 내용을  올립니다.>

The research paper I will explain in this article is 'CRISPR/Cas9 - mediated mutagenesis of the dihydroflavonol - 4 - reductase - B (DFR - B) locus in the Japanese morning glory Ipomoea (Pharbitis) nil'. I will first clarify some words that are difficult to students.

제가 이 글에서 설명할 논문은 'CRISPR/Cas9 - mediated mutagenesis of the dihydroflavonol - 4 - reductase - B (DFR - B) locus in the Japanese morning glory Ipomoea (Pharbitis) nil' 입니다. 먼저, 학생들이 이해하기 어려운 단어들을 설명하겠습니다.

• Mediate: Bring about a result. (Ex: Physical effects)
• Mediate: 어떠한 결과를 드러내다.
• Locus: A fixed position on a chromosome.
• Locus: 염색체 내에 있는 한 장소 혹은 구간
• Gene: A locus of DNA.
• Gene: 유전자. 유전의 기본단위이며, 한 구간 (Locus)에 있는 DNA이라 생각하면 된다.
• Allele: A variation of a gene.
• Allele: 대립 형질. 게놈/유전체 내 유전자가 조절하는 하나의 형질에 대한 여러가지 종류.
• Mutagenesis: A process where genetic information of an organism is changed.
• Mutagenesis: 돌연변이 생성. 생물의 유전 정보가 바뀌는 과정.

Professor Michiyuki Ono and his team used the CRISPR - Cas9 technology to change the flower petal and stem color of the Japanese morning glory Ipomoea nil (I.nil). The gene dihydroflavonol - 4 - reductase - B (DFR - B) encodes/makes an anthocyanin (A pigment that shows the color purple and blue) biosynthesis enzyme. Anthocyanin is responsible for the purple color of I.nil. Null mutations (Mutations that results in elimination of the target gene's function) in I.nil's DFR - B gene (It will be called InDFR - B from now on. The 'In' is short for I.nil. In other words, InDFR - B is the DFR-B gene of I.nil. The same applies to DFR - A and DFR - C) resulted in anthocyanin - less stems, leaves and flowers. Therefore, that gene was selected as the target gene. The 20bp (Base pair) sequence in the 4th exon (Parts of a gene that encodes a part of the final mature mRNA and therefore contributing in transcription & translation) of InDFR - B was selected as the sgRNA sequence of the CRISPR - Cas9 system.

미치유키 오노 박사님과 그의 연구팀은 크리스퍼 - 카스9 기술을 이용해 일본 나팔꽃 Ipomoea nil (I.nil) 의 꽃잎과 줄기 색을 변형시켰습니다. 유전자 디하이드로플라보놀 - 4 - 리덕테이스 - B (DFR - B)는 안토시아닌 (보라색과 파란색을 띠는 색소) 을 만드는 효소를 만드는 유전자입니다. I.nil의 경우, 안토시아닌은 식물의 보라색/자주색 꽃잎, 줄기 등의 색을 책임집니다. I.nil의 DFR - B 유전자에 대해 그 유전자가 제 기능을 하지 못하게 하는 돌연변이는 안토시아닌이 없는 꽃, 줄기, 잎 등을 보여 그 유전자가 편집 대상으로 선정되었습니다. 그리고 InDFR - B의 넷째 엑손의 (단백질 합성 과정에서 mRNA가 만들어질 때, 단백질 합성에 관여하는 정보가 있어 '성숙한' mRNA에 그 정보가 실리는 DNA의 염기 서열 중 일부분) 20bp (Base pair, 염기쌍) 시퀀스가 크리스퍼 - 카스9 시스템의 싱글 가이드 RNA (sgRNA) 시퀀스로 선정되었습니다.

There was a problem: I.nil had other DFR species. The DFR in I.nil were InDFR - A, InDFR - Band InDFR - C. The two orthologous (Two or more species of sequences that are descended from the same ancestor sequence) sequences of InDFR - B had similar sgRNA sequence patterns. InDFR - A had a 19/20 match and InDFR - C had an 18/20 match with InDFR - B's 20bp sgRNA sequence. This could cause off - target effects which gives us unwanted results and errors. Fortunately, InDFR - B was the only gene that had the TGG PAM sequence which is necessary for the CRISPR - Cas9 system to function. Therefore, chances of possible off - target effects from InDFR - A and InDFR - C were null. Nine more sites were considered as potential off - target sites, but were later revealed to not having any mutations in them.

문제가 한가지 있었습니다. I.nil은 다른 DFR 종류가 있다는 겁니다. I.nil의 DFR 종류들은 InDFR - A, InDFR - B, InDFR - C입니다. InDFR - B의 20bp sgRNA 시퀀스가 있는 위치에 있는 InDFR - A와 InDFR - C의 염기서열들은 각각 19/20, 18/20 으로 InDFR - B와 일치합니다. 이는 크리스퍼 - 카스9 시스템이 우리가 원치 않는 위치에서 작용을 하는 오프 - 타켓 현상이 일어나게 해 실험 결과에 악영향을 줄 가능성이 있습니다. 다행스럽게도 크리스퍼 - 카스9 시스템이 작동을 하기 위해 필요한 TGG 팸 시퀀스는 InDFR - B에만 있어 InDFR - A와 InDFR - C에서 나타날 수 있는 오프 - 타겟 현상의 출현 가능성은 없는 것으로 결론되었습니다. 그 외 추가적으로 발견된 9개의 구간들이 잠재적인 오프 - 타겟 구간으로 선정되었으나 분석 결과, 그 구간들에서 발견된 돌연변이는 없는 것으로 밝혀졌습니다.

In the image above, the nucleotides that doesn't match with InDFR - B of InDFR - A  and InDFR - C are shown in black backgrounds. The 20bp sgRNA sequence is shown in blue and the PAM sequence is shown in red. The recognition site sequence / restriction site (The sequence that restriction enzymes recognize and starts functioning) of the restriction enzyme (An enzyme that cleaves DNA into fragments) SpeI is underlined with green and the expected cleavage site of the CRISPR - Cas9 system is indicated with the green triangle. 

As you can see, the expected cleavage site of the CRISPR - Cas9 system and the recognition site of SpeI overlaps with each other. This means that if proper cleavage in that site by CRISPR - Cas9 and NHEJ (Non Homologous End Joining. It's a method that cells use to repair double strand breaks in DNA) happens, the restriction site would be broken by CRISPR - Cas9. Resulting in no cleavage or 'digestion' of that sequence by SpeI in the restriction digest procedure.

I think this is a very clever way to figure out if the cleavage by CRISPR - Cas9 has occurred as expected. With this method, we can figure out if CRISPR - Cas9 did its job correctly just by analyzing weather or not our target sequence has undergone digestion by SpeI.

Analysis was proceeded via Agarose gel electrophoresis (A method for separating and analyzing DNA, RNA and protiens by their size and charge. Agarose gel is used in this method). Shifting in colors (Example: Purple flower petals turning white) were not observed during plant growth.

위 이미지에서 보면 InDFR - B의 염기서열과 일치하지 않는 InDFR - A와 InDFR - C의 뉴클레오타이드는 검은색 배경으로 칠해져 있으며, InDFR - B의 20bp sgRNA시퀀스는 파란색, 팸 시퀀스는 빨간색으로 나타났습니다. 제한 효소인 SpeI의 인식 부위 / 제한 부위 시퀀스는 초록색 밑줄, 크리스퍼 - 카스9 시스템의 예상 절단 부위는초록색 역삼각형 아래의 구간으로 표시되었습니다.

보시다시피, 크리스퍼 - 카스9 시스템의 예상 절단 부위는 제한 효소 SpeI의 제한 부위와 겹칩니다. 이는 크리스퍼 - 카스9 시스템이 제대로 제 역할을 하고 NHEJ (Non Homologous End Joining 의 약자. 한국어는 비상동말단연결이며, 이는 DNA의 이중가닥 절단을 수선하는 방법 중 하나이다) 가 발생하면 제한 부위는 크리스퍼 - 카스9 시스템에 의해 절단남을 의미합니다. 그로 인해 제한 효소 SpeI가 그 제한 부위에서 제 기능을 하지 못하게 합니다.

저는 이 방법이 크리스퍼 - 카스9이 예상대로 절단 부위를 제대로 절단했는지 안했는지 구분하는 데에 쓸 수 있는 매우 유용한 방법이라고 생각합니다. 제한 효소 SpeI에 의해 우리의 타겟 시퀀스 (싱글 가이드 RNA 시퀀스) 가 절단되었는지 안되었는지의 여부로 크리스퍼 - 카스9 시스템이 작동을 잘했는지 안했는지의 여부를 알 수 있기 때문입니다. 분석은 아가로스 겔 전기영동법 (DNA, RNA, 단백질을 크기와 전하량에 따라 분리시키고 분석하는 방법 중 하나로, 아가로스 겔을 이용한다) 으로 시행했으며, 각 개체의 성장기간 동안 꽃잎과 줄기의 색 변화 (예: 자라면서 원래 보라색이었던 꽃잎이 어느날 갑자기 흰색을 띠는 등의 현상. 실험을 통해 만들어진 원래 하얀색이었던 꽃의 꽃잎이 계속 하얀색인 것은 포함되지 않는다) 는 관찰되지 않은 것으로 나타났습니다.

The image above shows us two individuals of I.nil. The left one is a non - transgenic (Having no insertions or deletions) I.nil and the right one is a biallelically mutated (Both alleles having mutations) I.nil. The left one has a purple / violet stem just like the wild type I.nil. However, the right one has a green stem showing phenotypic differences between the two plant individuals.

위 이미지는 두 개의 I.nil 개체를 보여줍니다. 왼쪽은 크리스퍼 - 카스9에 의해 절단 부위가 절단되었으나, 그 뒤 이식 혹은 삭제된 염기가 없는 I.nil이며, 오른쪽은 두 대립 형질 다 돌연변이가 생긴 I.nil입니다. 왼쪽은 자연 상태의 I.nil처럼 보라색 / 자주색 줄기를 가지고 있지만, 오른쪽은 초록색 줄기를 가지고 있어 두 개체 사이에서 발생한 표현형의 차이를 보여줍니다.

NT is short for Non - Transgenic. The maximum of the insertion of nucleotides by NHEJ is 1bp, and the deletion has a range of 2 ~ 98bp. #9-1, #39-1 are biallelic mutants and #8-1, #36-2 are monoallelic (One allele has the mutation) mutants.

NT는 Non - Transgenic의 약자로, 크리스퍼 - 카스9에 의해 절단 부위가 절단되었으나, 그 뒤 이식 혹은 삭제된 염기가 없는 상태를 뜻합니다. NHEJ에 의해 이식된 염기의 최대값은 1bp이며, 삭제된 염기는 2~98bp까지 있는 것으로 나타났습니다. 위 이미지의 #9-1, #39-1은 두 대립 형질 다 돌연변이가 생겼으며, #8-1, #36-2는 한 대립 형질은 돌연변이이고 다른 것은 정상인 것으로 나타났습니다.

In the image above, you can see three half - ovals that has the letters L1, L2, L3 on them. This is called a meristem. A meristem is a tissue in plants containing undifferentiated cells. They are found in places where plant growth can take place. Each domain where the letters take place are the layers of the meristem. The L1 layer controls most of the flower petal color. The L2 layer controls the stem color and also slightly contributes to the petal color. The L3 layer forms tissues of roots and others. Since the L2 layer slightly contributes to the petal color, #36-2 has a slight shade of purple for the petal color despite having mutations in the L1 layer.

Professor Ono's team concluded the monoallelic mutants #8-1 and #36-2 to be a L2 periclinal chimera and a L1 periclinal chimera respectively. Periclinal means having one component/tissue completely surrounded by the other component/tissue. In genetics, a chimera (Or chimaera) is an organism having two or more sets of DNA and therefore having multiple genotypic traits in one organism. The conclusion makes sense because the two monoallelic mutants are chimeras where the L3 layer is completely surrounded by the L2 layer which is completely surrounded by the L1 layer. 

위 이미지에서 L1, L2, L3가 적혀있는 반 - 타원이 보이실텐데, 이는 분열조직이라 합니다. 분열조직은 아직 분화되지 않은 세포들로 이루어져 있는 조직으로, 세포 분열 및 분화를 하여 식물을 성장하게 합니다. 글자들이 적혀있는 각 구간들은 분열조직의 층입니다. L1층은 꽃잎의 색의 대부분을 조절하고, L2층은 줄기 색을 조절하며, 꽃잎의 색에 조금 관여합니다. L3층은 뿌리 등의 기관들의 조직을 형성합니다. L2층이 꽃잎 색깔에 관여를 하기 때문에 #36-2는 꽃잎의 색이 L1층에 흰색을 띠게 하는 돌연변이를 가진 세포들만 있는데도 불구하고 L2층이 보라색을 띠게 하는 정상 세포들을 가지고 있어 연한 보라색을 띠게 된 것입니다.

오노 박사님의 연구팀은 #8-1과 #36-2를 L2 둘러쌈 키메라, L1 둘러쌈 키메라임을 결론지었습니다. 키메라는 여러가지 유전형을 가진 하나의 생물을 뜻하는 단어입니다. #8-1과 #36-2는 L3층이 L2층에 의해 완전히 둘러싸여 있고 또 L2층이 L1층에 의해 완전히 둘러싸여 있는 구조를 가진 키메라라서 이 결론이 맞다는 것을 알 수 있습니다.

The periclinal mutants #8-1, #36-2 bore sectorial flowers that were part white only once in their lifetime. The team thought of two potential reasons for the causation of this phenomenon. The first reason is somaclonal mutations/variations. Somaclonal variation is the variation seen in plants that are produced by plant tissue culture (Techniques used to maintain or grow plant cells and tissues).

The second reason is "Invasion of cells from an adjacent layer". I approached this sentence's meaning as "Cells from layers close to each other in one individual organism like the L1 and L2 layer somehow found a way to 'invade' the other layer and differentiated in that layer. Resulting in white sectorial parts in the flower petals". The white sectors were analyzed and were confirmed to be biallelic. It is interesting how this phenomenon happens only once during the organism's lifetime.

둘러쌈 돌연변이인 #8-1, #36-2는 생애에 딱 한번만 꽃잎에 부채꼴 모양으로 하얀색 부분이 나타나는 것이 관찰되었습니다. 연구팀은 이 현상에 대한 잠재적 이유를 두 가지 냈습니다. 첫 번째 이유는 체세포영양계 변이 때문입니다. 체세포영양계 변이는 식물조직 배양에 의해 나타나는 변이입니다.

두 번째 이유는 "인접한 세포들의 침입" 때문입니다. 저는 이 문장의 의미를 "L1, L2층처럼 하나의 생물 내 인접한 층들 사이 세포들이 상대 층으로 들어가 그 층에서 분화를 해 흰색 부채꼴 모양의 꽃잎이 보이게 했다" 로 이해했습니다. 그 흰색 부분들을 분석한 결과, 두 대립 형질 다 돌연변이가 있는 것으로 드러났습니다. 이 현상은 개체의 생애에 딱 한번만 일어난다는 점이 매우 흥미로웠습니다. 

My explanation ends here. I hope what I wrote helped other students to learn and understand science better.

제 설명은 여기까지입니다. 제가 쓴 내용이 다른 학생들이 과학을 배우고 이해하는데에 도움이 되었으면 합니다.

                                                             < 10/17, 2017 >

                                                                Haein Kim

                                                                   김해인

Research paper (해당 논문): https://www.nature.com/articles/s41598-017-10715-1

Images from the Research paper.

First Ipomoea nil image from wikipedia(나팔꽃 이미지): https://en.wikipedia.org/wiki/Ipomoea_nil

Sites that helped me to understand the research paper better:

도움이 된 사이트들:

• About Chimeras: https://www.britannica.com/topic/chimera-genetics 
• About Gel electrophoresis: https://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophoresis
• About NHEJ: https://en.wikipedia.org/wiki/Non-homologous_end_joining
• About Exons: https://en.wikipedia.org/wiki/Exon
• About Somaclonal variations: https://en.wikipedia.org/wiki/Somaclonal_variation
• About Plant tissue culture: https://en.wikipedia.org/wiki/Plant_tissue_culture
• About Null mutations: http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/null+mutation
• About Meristems: https://en.wikipedia.org/wiki/Meristem

The article I'll be explaining is "Single master regulatory gene coordinates the evolution and development of butterfly color and iridescence". This article was shared by prof. Robert D. Reed and his team.

  Scientists used to think that multiple genes were responsible for the wing color and patterns of butterflies by interacting with each other. The article itself states that dozens of genes were implicated in wing pattern development as well. But researches showed that only a few genes owned the role of actual, effective causation of the difference in wing color and patterns. The optix gene was one of them. However, the actual developmental function of optix was unclear. This article shows that the optix gene is responsible for the determination of chromatic coloration by repression of melanins and promotion of ommochromes, iridescence and wing scale structure in nymphalid butterflies (Also known as "four - footed butterflies"). The team used the CRISPR - cas9 technology to drive targeted deletion of the optix gene in four species of the Nymphalidae.

  제가 이번에 설명할 논문은 "Single master regulatory gene coordinates the evolution and development of butterfly color and iridescence" 입니다. 이 논문은 로버트 리드 박사님과 그의 연구팀이 작성했습니다.

  과학자들은 나비들의 날개 색과 무늬들을 결정하는 유전자들은 많으며, 그들이 만들어내는 형질들이 섞여져서 색과 무늬들이 나온다고 생각했었습니다. 논문 자체에서도 여러 유전자들이 날개 무늬와 관련 있음을 알려줍니다. 하지만 연구 결과, 몇몇개의 유전자들만이 실제로 나비 날개의 색 및 무늬 차이의 효과가 크게 나타나게 함을 알게되었습니다. optix (옵틱스) 유전자가 그들 중 하나입니다. 그러나, 옵틱스의 실질적인 기능은 불확실했습니다. 이 논문은 옵틱스 유전자가 멜라닌 억제 및 오모크롬 촉진으로 네발나비과 나비들의 날개 비늘 구조, 날개 색 및 무지개빛 (방향적 구조색)의 결정을 책임짐을 보여줍니다. 팀은 크리스퍼 - 카스9 기술을 이용해 4 종의 네발나비과 나비들의 옵틱스 유전자를 삭제했습니다.

The nymphalids are -

이 글에 나오는 네발나비과 나비들은 - 

• H. erato
• A. vanillae
• V. cardui
• J. coenia

• Structural coloration: Production of color by microscopically structured surfaces that interfere with light.
• 구조색: 빛을 간섭하는 마이크로 구조들에 의해 생기는 색.
• Iridescence: A phenomenon where surfaces change color depending on the angle of view.
• 방향적 구조색 (흔히 무지개빛이라고 한다): 보는 방향과 각도에 따라 표면의 색이 달라지는 현상.
• Ommochrome: Biological pigments that occur in the eyes of crustaceans and insects. They have a wide range of colors. In this case, the ommochrome is responsible for the red, orange and brown colors of the butterflies' wings.
• 오모크롬: 갑각류와 곤충들의 눈에 존재하는 색소로, 넓은 범위의 색을 가지고 있다. 이 경우에는, 나비들의 날개의 빨간색, 주황색, 갈색 색들을 만드는 역할을 한다.
• Melanin: Biological pigments that are responsible for the dark color (In this case, usually gray and black) of organisms.
• 멜라닌: 생물체들의 어두운 색 (이 경우에는, 회색과 검은색을 담당한다)을 만드는 색소다.
• Mosaic: An organism that has two or more populations of cells with different genotypes because of error during mitosis. Mosaics originates from one zygote, which makes them differ from Chimeras (Chimeras originate from multiple zygotes).
• 모자이크: 수정란이 세포 분열 중 오류로 인해 서로 다른 유전자형을 가진 둘 이상의 세포 집단을 가지게 되는 생물체로, 하나의 수정란에서 시작했기 때문에 둘 이상의 수정란이 혼합된 키메라들과 구분된다.
• Dorsal: The upper surface of the wing/body of an organism.
• Dorsal: 생물체의 등쪽, 날개 위쪽을 뜻하는 단어다.
• Ventral: The bottom surface of the wing/body of an organism.
• Ventral: 생물체의 배쪽, 날개 아래쪽을 뜻하는 단어다.
• Basal area: The area near the base of the wings.
• Basal area (기저 구역): 날개가 몸 (머리, 가슴, 배 통틀음)과 가장 가까운 곳 주위 구역.
• Discal area: The area next to the basal area. You can think of it being the 2/3 part of each wing.
• Discal area: Basal area 옆 구역으로, 각 날개를 3등분 했을 때, 중간에 해당하는 구역이다. 

Let's talk about H. erato first.

H. erato에 대해 먼저 말하겠습니다.

  You can see that the red ommochrome has changed into black melanin.

  빨간색 오모크롬이 검은색 멜라닌으로 바뀌었음을 볼 수 있습니다.

  B shows the obvious color difference between the wild type (Abbreviated as "WT") and the mutant wing patterns. C, C’, C” shows the difference in wing scale morphology (Shape) and color. Each one is the zoomed in version of the previous one. C” shows that the WT wing scale has a pointed structure, while the mutant wing scale has the normal, relatively roundish structure. As mentioned in the article itself, the results showed that the optix gene acts as an "or" switch between ommochrome and melanin.

  B는 야생형 ("WT"로 줄여 표기)과 돌연변이 날개 무늬들의 분명한 색 차이를 보여줍니다. C, C’, C”은 그들의 날개 비늘 모양과 색의 차이를 점점 확대해 보여줍니다. 여기서 C”은 WT 날개 비늘은 뾰족한 모양이며, 돌연변이 비늘은 상대적으로 둥글둥글한, 일반적인 모양을 가짐을 보여줍니다. 논문 자체에서도 말했듯이, 결과들이 옵틱스 유전자가 오모크롬과 멜라닌 사이에 작용하는 "또는" 스위치 역할을 함을 보여주었습니다.

Second is A. vanillae.

두번째는 A. vanillae 입니다.

  Both dorsal and ventral wings show that the orange and brown ommochrome wing scales have turned into black and silver melanin wing scales. The green arrows on the ventral mutant wing show the WT wing scales that turned into silver patches. This was called the "presumptive clone boundaries". I assume it was called that way because the wing scales outside the "clone boundaries" have its while spots unchanged and has minor change in overall wing color (Dark gold-ish forewing top part and hindwing → Light brownish & black forewing top part and black hindwing).

  등쪽과 배쪽 날개에 있는 주황색, 갈색 오모크롬 날개 비늘들이 검은색과 은색 멜라닌을 가진 날개 비늘로 바뀜을 보여줍니다. 돌연변이 나비의 배쪽 날개에 있는 초록색 화살표는 은색으로 변한 야생형 날개 비늘들을 보여줍니다. 이들은 "추정적 클론 경계"라 불렸습니다. 아마 돌연변이의 "클론 경계" 바깥의 날개 비늘들의 하얀색 점들은 바뀌지 않았으며, 전체적인 날개의 색은 변화가 거의 일어나지 않았기 때문으로 저는 생각합니다 (앞날개의 위쪽 어두운 금색 부분과 하얀색 점들을 제외한 뒷날개 전체 → 앞날개의 위쪽은 연한 갈색 & 검은색으로 변하고 뒷날개는 하얀색 점들을 제외하고 검은색이 되었음).

  E shows the zoomed in detail of the knockout clone boundary and the switch of colors between red (WT) and black (Mutant) in the ventral forewing. F was a very interesting picture to see. Some of you reading this might've noticed the three black spots relatively darker than the overall black color of the wing by deletion of the optix gene of the mutant A. vanillae in the first picture that shows A. vanillae. Your eyes weren't wrong. The spots are darker than the usual "black" of the mutant A. vanillae wing. F shows the black spots with white arrows. Also, the black spots can be clearly seen on the ventral wing of the WT A. vanillae. The phenotypic trait of the WT A. vanillae wing didn't change in the case of the mutant A. vanillae wing.

  Here's one more interesting fact: The parts of the A. vanillae wing that didn't change after optix gene knockout are all from the ventral wing. I assume these unchanged patterns are controlled by factors other than the optix gene. G and G’ shows the WT and mutant wing scale morphology from pointed to normal and the color change between WT and the mutant wing scale.

  E는 배쪽 앞날개에 있는 클론 경계를 확대한 모습을 보여주며, 이에서 빨간색 (야생형)에서 검은색 (돌연변이)로 색이 바뀜을 알 수 있습니다. F는 매우 흥미로운 사진이이었습니다. 아마 이 글을 보시는 독자 여러분 중 몇분께서는 A. vanillae를 처음으로 보여주는 사진에서 optix 유전자의 삭제에 의한 돌연변이 A. vanillae의 검은색 배쪽 날개보다 더 어두운 3개의 검은색 점들을 보신 분들도 계실겁니다. 잘못 본 것이 아닙니다. 그 점들은 진짜로 돌연변이 A. vanillae의 검은색 배쪽 날개보다 더 어둡습니다. F에서는 그 점들을 하얀색 화살표로 표시했습니다. 또한, 그 검은 점들은 야생형 A. vanillae의 배쪽 날개에서 눈에 띄게 보입니다. 야생형 A. vanillae 날개의 표현형 형질이 돌연변이의 경우에서도 바뀌지 않은 것입니다.

  흥미로운 점을 또 한가지 더 쓰겠습니다: A. vanillae의 optix 유전자가 삭제된 뒤에도 바뀌지 않은 부분들은 모두 배쪽 날개에 있다는 겁니다. 저는 이러한 변화가 없는 부분들은 optix 유전자 이외의 다른 인자들에 의해 조종되기 때문으로 예상합니다. G와 G’은 날개 비늘의 모양이 뾰족한 모양 (야생형)에서 둥근 일반적인 모양 (돌연변이)로 변화된 모습과 야생형과 돌연변이 날개 비늘의 색 변화를 보여줍니다.

Third is V. cardui.

세번째는 V. cardui 입니다.

  There is a pretty noticeable difference in the mutant ventral wing compared to the previous two butterflies. We can see that the orange part of the WT ventral wing lost its color, meaning the loss of ommochrome has happened as usual. But unlike previous butterflies, hypermelanization (Formation of dark colors in an organism by increased concentration of melanin) was very low. This produced a mutant ventral wing with widespread white colors shown in the picture above.

  돌연변이 나비의 배쪽 날개는 이전 나비들과 다른 특이점을 보여줍니다. 야생형 나비의 배쪽 날개의 주황색 부분들은 색을 잃었으므로, 늘 그랬듯이 오모크롬이 감소/사라졌음을 보여줍니다. 하지만 이전 나비들과 다르게 과멜라닌화 현상 (멜라닌 색소의 농도가 높아짐으로서 생물체한테서 어두운 색이 보이는 현상) 은 매우 적게 나타났습니다. 이는 위 사진과 같이 하얀색이 주로 퍼져있는 돌연변이 배쪽 날개를 만들게 되었습니다.

  B shows melanization of the red/orange parts of the mutant butterflies. C and D shows the phenomenon of loss of ommochrome and low hypermelanization in the ventral forewing and hindwing, respectively.

  B는 돌연변이 나비들의 빨간색/주황색 부분들이 멜라닌화되는 모습을 보여줍니다. C와 D는 배쪽 날개의 앞, 뒷날개의 오모크롬의 감소와 과멜라닌화 현상이 나타나지 않는 모습을 보여줍니다.

  The low hypermelanization didn't happen to all V. cardui butterflies. The team was able to recover late stage pupal V. cardui wings that died before emergence. As shown in the picture above, the mutant late stage pupal ventral V. cardui wings showed hypermelanization in locations where the red ommochromes used to be. The team speculated that this variable strength of ventral wing pattern melanization reflected a dosage effect (The alteration of a phenotype by an increased dosage/amount of the product of a gene), where the phenotypes with stronger melanization representing biallelic optix deletion clones. However, there's no direct evidence to support the speculation. So the reason for the causation of this phenomenon is yet unknown.

  하지만, 모든 V. cardui 나비들한테서 과멜라닌화 현상이 나타나지 않은 것은 아닙니다. 연구팀은 번데기 말기 시기에 죽은 V. cardui 의 날개를 얻는데에 성공했으며, 위 사진에서 보이듯이, 돌연변이 번데기 말기 시기 V. cardui 는 빨간색 오모크롬이 있던 자리에 과멜라닌화 현상이 나타났습니다. 연구팀은 이러한 배쪽 날개 무늬의 멜라닌화 정도의 차이가 유전자량 효과 (어떤 특정 유전자의 생성물의 양이 증가함으로서 표현형이 변화하는 효과) 를 나타내며, 멜라닌화 현상이 더 강하게 나타난 생물체들은 두 대립 형질 모두 돌연변이가 생겼다고 추측했습니다. 그러나, 이 추측을 뒷받침할만한 증거는 없기 때문에 이 현상이 나타나는 이유는 아직 미확인 상태입니다.

  F shows the conversion of scale morphology from pointed (WT) to normal (Mutant).

  F는 날개 비늘 모양이 뾰족한 모양 (야생형)에서 둥근, 일반적인 모양 (돌연변이)으로 변하는 모습을 보여줍니다.

Fourth is J. coenia.

네번째는 J. coenia 입니다.

  The mutant wings of J. coenia has something unique compared to the previous three. It is structural iridescence. The wings on the very right of picture A are additional phenotypes of mutant J. coenia butterflies. As described in both pictures above, you can see strong, bluish iridescence on the dorsal discal spot and eyespot ring. The ventral wing has less iridescence compared to the dorsal wing. Instead, the ventral wing usually showed melanization of the orange patterns. Heavily "already melanized" WT patterns like the black tips of the forewing didn't go under iridescence.

  돌연변이 J. coenia의 날개들은 이전 나비들과는 다른 특징을 보여줍니다. 눈에 띄는 푸른 방향적 구조색입니다. 사진 A의 맨 오른쪽에 있는 날개들은 돌연변이 J. coenia 나비들의 날개들의 추가적인 표현형을 보여줍니다. 위 두 사진에서 보이듯이, 돌연변이 나비의 등쪽 날개의 2/3 부분과 "눈알" 모양 주변 고리의 구조색이 변형되어 푸른색을 띰을 볼 수 있습니다. 배쪽 날개는 등쪽 날개에 비해 구조색이 덜 변형되었습니다. 그 대신에 배쪽 날개는 주황색 무늬들의 멜라닌화가 주로 일어났습니다. 앞날개의 검은 부분들과 같이 "이미 강하게 멜라닌화된" 야생형 나비의 날개 무늬들은 구조색이 푸른색으로 바뀌지 않았습니다.

  C shows the mutant ventral J. coenia wing shown in the white dotted box in A. As you can see, the orange patterns in the WT ventral wing has undergone melanization.

  C는 A에서 돌연변이 J. coenia의 배쪽 날개에 하얀색 점선으로 이루어진 공간에 보여진 부분을 확대해 보여주었습니다. 야생형 나비의 배쪽 날개에 있던 주황색 무늬들이 멜라닌화되었음을 볼 수 있습니다.

  D shows detail of the iridescence on the ventral hindwing. The "bluish" parts are the parts that has iridescence.

  D는 배쪽 뒷날개에 일어난 구조색의 변형을 확대해 보여줍니다. "푸른" 부분들이 다 구조색이 변형된 부분들입니다.

  E shows the variations of the patterns in dorsal forewings. The left one shows iridescence while the right one shows melanization.

  E는 등쪽 앞날개에 있는 무늬들의 종류를 보여줍니다. 왼쪽은 구조색이 바뀌어 푸른색을 띄고 오른쪽은 무늬들이 멜라닌화되었음을 보여줍니다.

  F shows the difference in morphology of the wing scales between WT and the mutant. The results in J. coenia showed that the optix gene acts as a repressor of structural iridescence in this species.

  F는 야생형과 돌연변이 나비들의 날개 비늘 모양의 차이를 보여줍니다. J. coenia에서 나온 결과들은 optix 유전자가 이 종의 나비들의 날개 비늘의 구조색 변형을 억제하는 기능을 가짐을 보여주었습니다.

  The results from the four nymphalids showed that the optix gene acts as an "or" switch between ommochrome and melanin. But as seen in V. cardui, it may act as an "and" switch in some cases. The optix gene also has an influence to the structure of the wing scales by making them from pointed to normal, round scales.

  4 종의 네발나비과 나비들에서 나온 결과들은 optix 유전자가 오모크롬과 멜라닌 사이에 "또는" 스위치의 역할을 가짐을 보여주었습니다. 하지만 V. cardui 에서 봤듯이, 어떤 경우에는 "그리고" 스위치의 역할을 가지기도 합니다. 또한, optix 유전자는 날개 비늘의 모양을 뾰족한 모양에서 둥근 모양으로 바꿔 날개 비늘 모양/구조에 영향을 줍니다.

  If you look at the bottom wing set of picture A in the case of J. coenia, you'll see that I crossed out the "dorsal" part and fixed it to "ventral". When I was reading the article, I saw picture A having two wing sets both being dorsal wings. I had a bit of suspicion since the previous ones showed both dorsal and ventral wings together. Further reading made me conclude that the second set of wings are ventral. I sent an email to prof. Robert D. Reed and asked him for clarifications.

  J. coenia 의 경우의 사진 A를 보면 제가 "dorsal" (등쪽) 이라 쓴 부분을 "ventral" (배쪽) 이라 고쳐썼음을 볼 수 있을 겁니다. 제가 이 논문을 읽고 있었을 때, 사진 A가 등쪽 날개 두 그룹을 가지고 있음을 보여주었습니다. 이전 나비들은 등쪽과 배쪽 날개 모두 보여주었기 때문에 저는 이에 대해 의심이 들었습니다. 계속 읽어본 결과, 저는 두번째/아래 날개 그룹은 배쪽 날개임을 확신했습니다. 그 뒤, Robert D. Reed 박사님께 이메일을 보내 이에 대해 여쭈어봤습니다.

Here is the email:

  A few days later, he replied to me:

  I was very happy that he read and replied to my email. The reply email confirmed the error and therefore letting me fix the picture's annotation.

I wish this article helped students understand and learn biology better.

<11/17, 2017>

Haein Kim (김해인)

Credits:

• The article
• News from nature about this article

Additional sites that helped me understand scientific terms used in the article:

• Butterfly term explanation
• About iridescence
• About melanins
• About ommochromes
• About mosaics
• About the Nymphalidae
• About the dosage effect

The research paper I will explain in this article is 'CRISPR/Cas9 - mediated mutagenesis of the dihydroflavonol - 4 - reductase - B (DFR - B) locus in the Japanese morning glory Ipomoea (Pharbitis) nil'. I will first clarify some words that are difficult to students.

제가 이 글에서 설명할 논문은 'CRISPR/Cas9 - mediated mutagenesis of the dihydroflavonol - 4 - reductase - B (DFR - B) locus in the Japanese morning glory Ipomoea (Pharbitis) nil' 입니다. 먼저, 학생들이 이해하기 어려운 단어들을 설명하겠습니다.

• Mediate: Bring about a result. (Ex: Physical effects)
• Mediate: 어떠한 결과를 드러내다.
• Locus: A fixed position on a chromosome.
• Locus: 염색체 내에 있는 한 장소 혹은 구간
• Gene: A locus of DNA.
• Gene: 유전자. 유전의 기본단위이며, 한 구간 (Locus)에 있는 DNA이라 생각하면 된다.
• Allele: A variation of a gene.
• Allele: 대립 형질. 게놈/유전체 내 유전자가 조절하는 하나의 형질에 대한 여러가지 종류.
• Mutagenesis: A process where genetic information of an organism is changed.
• Mutagenesis: 돌연변이 생성. 생물의 유전 정보가 바뀌는 과정.

Professor Michiyuki Ono and his team used the CRISPR - Cas9 technology to change the flower petal and stem color of the Japanese morning glory Ipomoea nil (I.nil). The gene dihydroflavonol - 4 - reductase - B (DFR - B) encodes/makes an anthocyanin (A pigment that shows the color purple and blue) biosynthesis enzyme. Anthocyanin is responsible for the purple color of I.nil. Null mutations (Mutations that results in elimination of the target gene's function) in I.nil's DFR - B gene (It will be called InDFR - B from now on. The 'In' is short for I.nil. In other words, InDFR - B is the DFR-B gene of I.nil. The same applies to DFR - A and DFR - C) resulted in anthocyanin - less stems, leaves and flowers. Therefore, that gene was selected as the target gene. The 20bp (Base pair) sequence in the 4th exon (Parts of a gene that encodes a part of the final mature mRNA and therefore contributing in transcription & translation) of InDFR - B was selected as the sgRNA sequence of the CRISPR - Cas9 system.

미치유키 오노 박사님과 그의 연구팀은 크리스퍼 - 카스9 기술을 이용해 일본 나팔꽃 Ipomoea nil (I.nil) 의 꽃잎과 줄기 색을 변형시켰습니다. 유전자 디하이드로플라보놀 - 4 - 리덕테이스 - B (DFR - B)는 안토시아닌 (보라색과 파란색을 띠는 색소) 을 만드는 효소를 만드는 유전자입니다. I.nil의 경우, 안토시아닌은 식물의 보라색/자주색 꽃잎, 줄기 등의 색을 책임집니다. I.nil의 DFR - B 유전자에 대해 그 유전자가 제 기능을 하지 못하게 하는 돌연변이는 안토시아닌이 없는 꽃, 줄기, 잎 등을 보여 그 유전자가 편집 대상으로 선정되었습니다. 그리고 InDFR - B의 넷째 엑손의 (단백질 합성 과정에서 mRNA가 만들어질 때, 단백질 합성에 관여하는 정보가 있어 '성숙한' mRNA에 그 정보가 실리는 DNA의 염기 서열 중 일부분) 20bp (Base pair, 염기쌍) 시퀀스가 크리스퍼 - 카스9 시스템의 싱글 가이드 RNA (sgRNA) 시퀀스로 선정되었습니다.

There was a problem: I.nil had other DFR species. The DFR in I.nil were InDFR - A, InDFR - B and InDFR - C. The two orthologous (Two or more species of sequences that are descended from the same ancestor sequence) sequences of InDFR - B had similar sgRNA sequence patterns. InDFR - A had a 19/20 match and InDFR - C had an 18/20 match with InDFR - B's 20bp sgRNA sequence. This could cause off - target effects which gives us unwanted results and errors. Fortunately, InDFR - B was the only gene that had the TGG PAM sequence which is necessary for the CRISPR - Cas9 system to function. Therefore, chances of possible off - target effects from InDFR - A and InDFR - C were null. Nine more sites were considered as potential off - target sites, but were later revealed to not having any mutations in them.

문제가 한가지 있었습니다. I.nil은 다른 DFR 종류가 있다는 겁니다. I.nil의 DFR 종류들은 InDFR - A, InDFR - B, InDFR - C입니다. InDFR - B의 20bp sgRNA 시퀀스가 있는 위치에 있는 InDFR - A와 InDFR - C의 염기서열들은 각각 19/20, 18/20 으로 InDFR - B와 일치합니다. 이는 크리스퍼 - 카스9 시스템이 우리가 원치 않는 위치에서 작용을 하는 오프 - 타켓 현상이 일어나게 해 실험 결과에 악영향을 줄 가능성이 있습니다. 다행스럽게도 크리스퍼 - 카스9 시스템이 작동을 하기 위해 필요한 TGG 팸 시퀀스는 InDFR - B에만 있어 InDFR - A와 InDFR - C에서 나타날 수 있는 오프 - 타겟 현상의 출현 가능성은 없는 것으로 결론되었습니다. 그 외 추가적으로 발견된 9개의 구간들이 잠재적인 오프 - 타겟 구간으로 선정되었으나 분석 결과, 그 구간들에서 발견된 돌연변이는 없는 것으로 밝혀졌습니다.

In the image above, the nucleotides that doesn't match with InDFR - B of InDFR - A  and InDFR - C are shown in black backgrounds. The 20bp sgRNA sequence is shown in blue and the PAM sequence is shown in red. The recognition site sequence / restriction site (The sequence that restriction enzymes recognize and starts functioning) of the restriction enzyme (An enzyme that cleaves DNA into fragments) SpeI is underlined with green and the expected cleavage site of the CRISPR - Cas9 system is indicated with the green triangle. 

As you can see, the expected cleavage site of the CRISPR - Cas9 system and the recognition site of SpeI overlaps with each other. This means that if proper cleavage in that site by CRISPR - Cas9 and NHEJ (Non Homologous End Joining. It's a method that that cells use to repair double strand breaks in DNA) happens, the restriction site would be broken by CRISPR - Cas9. Resulting in no cleavage or 'digestion' of that sequence by SpeI in the restriction digest procedure.

I think this is a very clever way to figure out if the cleavage by CRISPR - Cas9 has occurred as expected. With this method, we can figure out if CRISPR - Cas9 did its job correctly just by analyzing weather or not our target sequence has undergone digestion by SpeI.

Analysis was proceeded via Agarose gel electrophoresis (A method for separating and analyzing DNA, RNA and protiens by their size and charge. Agarose gel is used in this method). Shifting in colors (Example: Purple flower petals turning white) were not observed during plant growth.

위 이미지에서 보면 InDFR - B의 염기서열과 일치하지 않는 InDFR - A와 InDFR - C의 뉴클레오타이드는 검은색 배경으로 칠해져 있으며, InDFR - B의 20bp sgRNA시퀀스는 파란색, 팸 시퀀스는 빨간색으로 나타났습니다. 제한 효소인 SpeI의 인식 부위 / 제한 부위 시퀀스는 초록색 밑줄, 크리스퍼 - 카스9 시스템의 예상 절단 부위는초록색 역삼각형 아래의 구간으로 표시되었습니다.

보시다시피, 크리스퍼 - 카스9 시스템의 예상 절단 부위는 제한 효소 SpeI의 제한 부위와 겹칩니다. 이는 크리스퍼 - 카스9 시스템이 제대로 제 역할을 하고 NHEJ (Non Homologous End Joining 의 약자. 한국어는 비상동말단연결이며, 이는 DNA의 이중가닥 절단을 수선하는 방법 중 하나이다) 가 발생하면 제한 부위는 크리스퍼 - 카스9 시스템에 의해 절단남을 의미합니다. 그로 인해 제한 효소 SpeI가 그 제한 부위에서 제 기능을 하지 못하게 합니다.

저는 이 방법이 크리스퍼 - 카스9이 예상대로 절단 부위를 제대로 절단했는지 안했는지 구분하는 데에 쓸 수 있는 매우 유용한 방법이라고 생각합니다. 제한 효소 SpeI에 의해 우리의 타겟 시퀀스 (싱글 가이드 RNA 시퀀스) 가 절단되었는지 안되었는지의 여부로 크리스퍼 - 카스9 시스템이 작동을 잘했는지 안했는지의 여부를 알 수 있기 때문입니다. 분석은 아가로스 겔 전기영동법 (DNA, RNA, 단백질을 크기와 전하량에 따라 분리시키고 분석하는 방법 중 하나로, 아가로스 겔을 이용한다) 으로 시행했으며, 각 개체의 성장기간 동안 꽃잎과 줄기의 색 변화 (예: 자라면서 원래 보라색이었던 꽃잎이 어느날 갑자기 흰색을 띠는 등의 현상. 실험을 통해 만들어진 원래 하얀색이었던 꽃의 꽃잎이 계속 하얀색인 것은 포함되지 않는다) 는 관찰되지 않은 것으로 나타났습니다.

The image above shows us two individuals of I.nil. The left one is a non - transgenic (Having no insertions or deletions) I.nil and the right one is a biallelically mutated (Both alleles having mutations) I.nil. The left one has a purple / violet stem just like the wild type I.nil. However, the right one has a green stem showing phenotypic differences between the two plant individuals.

위 이미지는 두 개의 I.nil 개체를 보여줍니다. 왼쪽은 크리스퍼 - 카스9에 의해 절단 부위가 절단되었으나, 그 뒤 이식 혹은 삭제된 염기가 없는 I.nil이며, 오른쪽은 두 대립 형질 다 돌연변이가 생긴 I.nil입니다. 왼쪽은 자연 상태의 I.nil처럼 보라색 / 자주색 줄기를 가지고 있지만, 오른쪽은 초록색 줄기를 가지고 있어 두 개체 사이에서 발생한 표현형의 차이를 보여줍니다.

NT is short for Non - Transgenic. The maximum of the insertion of nucleotides by NHEJ is 1bp, and the deletion has a range of 2 ~ 98bp. #9-1, #39-1 are biallelic mutants and #8-1, #36-2 are monoallelic (One allele has the mutation) mutants.

NT는 Non - Transgenic의 약자로, 크리스퍼 - 카스9에 의해 절단 부위가 절단되었으나, 그 뒤 이식 혹은 삭제된 염기가 없는 상태를 뜻합니다. NHEJ에 의해 이식된 염기의 최대값은 1bp이며, 삭제된 염기는 2~98bp까지 있는 것으로 나타났습니다. 위 이미지의 #9-1, #39-1은 두 대립 형질 다 돌연변이가 생겼으며, #8-1, #36-2는 한 대립 형질은 돌연변이이고 다른 것은 정상인 것으로 나타났습니다.

In the image above, you can see three half - ovals that has the letters L1, L2, L3 on them. This is called a meristem. A meristem is a tissue in plants containing undifferentiated cells. They are found in places where plant growth can take place. Each domain where the letters take place are the layers of the meristem. The L1 layer controls most of the flower petal color. The L2 layer controls the stem color and also slightly contributes to the petal color. The L3 layer forms tissues of roots and others. Since the L2 layer slightly contributes to the petal color, #36-2 has a slight shade of purple for the petal color despite having mutations in the L1 layer.

Professor Ono's team concluded the monoallelic mutants #8-1 and #36-2 to be a L2 periclinal chimera and a L1 periclinal chimera respectively. Periclinal means having one component/tissue completely surrounded by the other component/tissue. In genetics, a chimera (Or chimaera) is an organism having two or more sets of DNA and therefore having multiple genotypic traits in one organism. The conclusion makes sense because the two monoallelic mutants are chimeras where the L3 layer is completely surrounded by the L2 layer which is completely surrounded by the L1 layer. 

위 이미지에서 L1, L2, L3가 적혀있는 반 - 타원이 보이실텐데, 이는 분열조직이라 합니다. 분열조직은 아직 분화되지 않은 세포들로 이루어져 있는 조직으로, 세포 분열 및 분화를 하여 식물을 성장하게 합니다. 글자들이 적혀있는 각 구간들은 분열조직의 층입니다. L1층은 꽃잎의 색의 대부분을 조절하고, L2층은 줄기 색을 조절하며, 꽃잎의 색에 조금 관여합니다. L3층은 뿌리 등의 기관들의 조직을 형성합니다. L2층이 꽃잎 색깔에 관여를 하기 때문에 #36-2는 꽃잎의 색이 L1층에 흰색을 띠게 하는 돌연변이를 가진 세포들만 있는데도 불구하고 L2층이 보라색을 띠게 하는 정상 세포들을 가지고 있어 연한 보라색을 띠게 된 것입니다.

오노 박사님의 연구팀은 #8-1과 #36-2를 L2 둘러쌈 키메라, L1 둘러쌈 키메라임을 결론지었습니다. 키메라는 여러가지 유전형을 가진 하나의 생물을 뜻하는 단어입니다. #8-1과 #36-2는 L3층이 L2층에 의해 완전히 둘러싸여 있고 또 L2층이 L1층에 의해 완전히 둘러싸여 있는 구조를 가진 키메라라서 이 결론이 맞다는 것을 알 수 있습니다.

The periclinal mutants #8-1, #36-2 bore sectorial flowers that were part white only once in their lifetime. The team thought of two potential reasons for the causation of this phenomenon. The first reason is somaclonal mutations/variations. Somaclonal variation is the variation seen in plants that are produced by plant tissue culture (Techniques used to maintain or grow plant cells and tissues).

The second reason is "Invasion of cells from an adjacent layer". I approached this sentence's meaning as "Cells from layers close to each other in one individual organism like the L1 and L2 layer somehow found a way to 'invade' the other layer and differentiated in that layer. Resulting in white sectorial parts in the flower petals". The white sectors were analyzed and were confirmed to be biallelic. It is interesting how this phenomenon happens only once during the organism's lifetime.

둘러쌈 돌연변이인 #8-1, #36-2는 생애에 딱 한번만 꽃잎에 부채꼴 모양으로 하얀색 부분이 나타나는 것이 관찰되었습니다. 연구팀은 이 현상에 대한 잠재적 이유를 두 가지 냈습니다. 첫 번째 이유는 체세포영양계 변이 때문입니다. 체세포영양계 변이는 식물조직 배양에 의해 나타나는 변이입니다.

두 번째 이유는 "인접한 세포들의 침입" 때문입니다. 저는 이 문장의 의미를 "L1, L2층처럼 하나의 생물 내 인접한 층들 사이 세포들이 상대 층으로 들어가 그 층에서 분화를 해 흰색 부채꼴 모양의 꽃잎이 보이게 했다" 로 이해했습니다. 그 흰색 부분들을 분석한 결과, 두 대립 형질 다 돌연변이가 있는 것으로 드러났습니다. 이 현상은 개체의 생애에 딱 한번만 일어난다는 점이 매우 흥미로웠습니다. 

My explanation ends here. I hope what I wrote helped other students to learn and understand science better.

제 설명은 여기까지입니다. 제가 쓴 내용이 다른 학생들이 과학을 배우고 이해하는데에 도움이 되었으면 합니다.

                                                             < 10/17, 2017 >

                                                                Haein Kim

                                                                   김해인

Research paper (해당 논문): https://www.nature.com/articles/s41598-017-10715-1

Images from the Research paper.

First Ipomoea nil image from wikipedia(나팔꽃 이미지): https://en.wikipedia.org/wiki/Ipomoea_nil

Sites that helped me to understand the research paper better:

도움이 된 사이트들:

• About Chimeras: https://www.britannica.com/topic/chimera-genetics 
• About Gel electrophoresis: https://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophoresis
• About NHEJ: https://en.wikipedia.org/wiki/Non-homologous_end_joining
• About Exons: https://en.wikipedia.org/wiki/Exon
• About Somaclonal variations: https://en.wikipedia.org/wiki/Somaclonal_variation
• About Plant tissue culture: https://en.wikipedia.org/wiki/Plant_tissue_culture
• About Null mutations: http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/null+mutation
• About Meristems: https://en.wikipedia.org/wiki/Meristem