Using CRISPR and changing colors!

The research paper I will explain in this article is 'CRISPR/Cas9 - mediated mutagenesis of the dihydroflavonol - 4 - reductase - B (DFR - B) locus in the Japanese morning glory Ipomoea (Pharbitis) nil'. I will first clarify some words that are difficult to students.

제가 이 글에서 설명할 논문은 'CRISPR/Cas9 - mediated mutagenesis of the dihydroflavonol - 4 - reductase - B (DFR - B) locus in the Japanese morning glory Ipomoea (Pharbitis) nil' 입니다. 먼저, 학생들이 이해하기 어려운 단어들을 설명하겠습니다.

• Mediate: Bring about a result. (Ex: Physical effects)
• Mediate: 어떠한 결과를 드러내다.
• Locus: A fixed position on a chromosome.
• Locus: 염색체 내에 있는 한 장소 혹은 구간
• Gene: A locus of DNA.
• Gene: 유전자. 유전의 기본단위이며, 한 구간 (Locus)에 있는 DNA이라 생각하면 된다.
• Allele: A variation of a gene.
• Allele: 대립 형질. 게놈/유전체 내 유전자가 조절하는 하나의 형질에 대한 여러가지 종류.
• Mutagenesis: A process where genetic information of an organism is changed.
• Mutagenesis: 돌연변이 생성. 생물의 유전 정보가 바뀌는 과정.

                                                                         

Professor Michiyuki Ono and his team used the CRISPR - Cas9 technology to change the flower petal and stem color of the Japanese morning glory Ipomoea nil (I.nil). The gene dihydroflavonol - 4 - reductase - B (DFR - B) encodes/makes an anthocyanin (A pigment that shows the color purple and blue) biosynthesis enzyme. Anthocyanin is responsible for the purple color of I.nil. Null mutations (Mutations that results in elimination of the target gene's function) in I.nil's DFR - B gene (It will be called InDFR - B from now on. The 'In' is short for I.nil. In other words, InDFR - B is the DFR-B gene of I.nil. The same applies to DFR - A and DFR - C) resulted in anthocyanin - less stems, leaves and flowers. Therefore, that gene was selected as the target gene. The 20bp (Base pair) sequence in the 4th exon (Parts of a gene that encodes a part of the final mature mRNA and therefore contributing in transcription & translation) of InDFR - B was selected as the sgRNA sequence of the CRISPR - Cas9 system.

미치유키 오노 박사님과 그의 연구팀은 크리스퍼 - 카스9 기술을 이용해 일본 나팔꽃 Ipomoea nil (I.nil) 의 꽃잎과 줄기 색을 변형시켰습니다. 유전자 디하이드로플라보놀 - 4 - 리덕테이스 - B (DFR - B)는 안토시아닌 (보라색과 파란색을 띠는 색소) 을 만드는 효소를 만드는 유전자입니다. I.nil의 경우, 안토시아닌은 식물의 보라색/자주색 꽃잎, 줄기 등의 색을 책임집니다. I.nil의 DFR - B 유전자에 대해 그 유전자가 제 기능을 하지 못하게 하는 돌연변이는 안토시아닌이 없는 꽃, 줄기, 잎 등을 보여 그 유전자가 편집 대상으로 선정되었습니다. 그리고 InDFR - B의 넷째 엑손의 (단백질 합성 과정에서 mRNA가 만들어질 때, 단백질 합성에 관여하는 정보가 있어 '성숙한' mRNA에 그 정보가 실리는 DNA의 염기 서열 중 일부분) 20bp (Base pair, 염기쌍) 시퀀스가 크리스퍼 - 카스9 시스템의 싱글 가이드 RNA (sgRNA) 시퀀스로 선정되었습니다.

There was a problem: I.nil had other DFR species. The DFR in I.nil were InDFR - A, InDFR - B and InDFR - C. The two orthologous (Two or more species of sequences that are descended from the same ancestor sequence) sequences of InDFR - B had similar sgRNA sequence patterns. InDFR - A had a 19/20 match and InDFR - C had an 18/20 match with InDFR - B's 20bp sgRNA sequence. This could cause off - target effects which gives us unwanted results and errors. Fortunately, InDFR - B was the only gene that had the TGG PAM sequence which is necessary for the CRISPR - Cas9 system to function. Therefore, chances of possible off - target effects from InDFR - A and InDFR - C were null. Nine more sites were considered as potential off - target sites, but were later revealed to not having any mutations in them.

문제가 한가지 있었습니다. I.nil은 다른 DFR 종류가 있다는 겁니다. I.nil의 DFR 종류들은 InDFR - A, InDFR - B, InDFR - C입니다. InDFR - B의 20bp sgRNA 시퀀스가 있는 위치에 있는 InDFR - A와 InDFR - C의 염기서열들은 각각 19/20, 18/20 으로 InDFR - B와 일치합니다. 이는 크리스퍼 - 카스9 시스템이 우리가 원치 않는 위치에서 작용을 하는 오프 - 타켓 현상이 일어나게 해 실험 결과에 악영향을 줄 가능성이 있습니다. 다행스럽게도 크리스퍼 - 카스9 시스템이 작동을 하기 위해 필요한 TGG 팸 시퀀스는 InDFR - B에만 있어 InDFR - A와 InDFR - C에서 나타날 수 있는 오프 - 타겟 현상의 출현 가능성은 없는 것으로 결론되었습니다. 그 외 추가적으로 발견된 9개의 구간들이 잠재적인 오프 - 타겟 구간으로 선정되었으나 분석 결과, 그 구간들에서 발견된 돌연변이는 없는 것으로 밝혀졌습니다.

                                                                                               

In the image above, the nucleotides that doesn't match with InDFR - B of InDFR - A  and InDFR - C are shown in black backgrounds. The 20bp sgRNA sequence is shown in blue and the PAM sequence is shown in red. The recognition site sequence / restriction site (The sequence that restriction enzymes recognize and starts functioning) of the restriction enzyme (An enzyme that cleaves DNA into fragments) SpeI is underlined with green and the expected cleavage site of the CRISPR - Cas9 system is indicated with the green triangle. 

As you can see, the expected cleavage site of the CRISPR - Cas9 system and the recognition site of SpeI overlaps with each other. This means that if proper cleavage in that site by CRISPR - Cas9 and NHEJ (Non Homologous End Joining. It's a method that that cells use to repair double strand breaks in DNA) happens, the restriction site would be broken by CRISPR - Cas9. Resulting in no cleavage or 'digestion' of that sequence by SpeI in the restriction digest procedure.

I think this is a very clever way to figure out if the cleavage by CRISPR - Cas9 has occurred as expected. With this method, we can figure out if CRISPR - Cas9 did its job correctly just by analyzing weather or not our target sequence has undergone digestion by SpeI.

Analysis was proceeded via Agarose gel electrophoresis (A method for separating and analyzing DNA, RNA and protiens by their size and charge. Agarose gel is used in this method). Shifting in colors (Example: Purple flower petals turning white) were not observed during plant growth.

위 이미지에서 보면 InDFR - B의 염기서열과 일치하지 않는 InDFR - A와 InDFR - C의 뉴클레오타이드는 검은색 배경으로 칠해져 있으며, InDFR - B의 20bp sgRNA시퀀스는 파란색, 팸 시퀀스는 빨간색으로 나타났습니다. 제한 효소인 SpeI의 인식 부위 / 제한 부위 시퀀스는 초록색 밑줄, 크리스퍼 - 카스9 시스템의 예상 절단 부위는초록색 역삼각형 아래의 구간으로 표시되었습니다.

보시다시피, 크리스퍼 - 카스9 시스템의 예상 절단 부위는 제한 효소 SpeI의 제한 부위와 겹칩니다. 이는 크리스퍼 - 카스9 시스템이 제대로 제 역할을 하고 NHEJ (Non Homologous End Joining 의 약자. 한국어는 비상동말단연결이며, 이는 DNA의 이중가닥 절단을 수선하는 방법 중 하나이다) 가 발생하면 제한 부위는 크리스퍼 - 카스9 시스템에 의해 절단남을 의미합니다. 그로 인해 제한 효소 SpeI가 그 제한 부위에서 제 기능을 하지 못하게 합니다.

저는 이 방법이 크리스퍼 - 카스9이 예상대로 절단 부위를 제대로 절단했는지 안했는지 구분하는 데에 쓸 수 있는 매우 유용한 방법이라고 생각합니다. 제한 효소 SpeI에 의해 우리의 타겟 시퀀스 (싱글 가이드 RNA 시퀀스) 가 절단되었는지 안되었는지의 여부로 크리스퍼 - 카스9 시스템이 작동을 잘했는지 안했는지의 여부를 알 수 있기 때문입니다. 분석은 아가로스 겔 전기영동법 (DNA, RNA, 단백질을 크기와 전하량에 따라 분리시키고 분석하는 방법 중 하나로, 아가로스 겔을 이용한다) 으로 시행했으며, 각 개체의 성장기간 동안 꽃잎과 줄기의 색 변화 (예: 자라면서 원래 보라색이었던 꽃잎이 어느날 갑자기 흰색을 띠는 등의 현상. 실험을 통해 만들어진 원래 하얀색이었던 꽃의 꽃잎이 계속 하얀색인 것은 포함되지 않는다) 는 관찰되지 않은 것으로 나타났습니다.

The image above shows us two individuals of I.nil. The left one is a non - transgenic (Having no insertions or deletions) I.nil and the right one is a biallelically mutated (Both alleles having mutations) I.nil. The left one has a purple / violet stem just like the wild type I.nil. However, the right one has a green stem showing phenotypic differences between the two plant individuals.

위 이미지는 두 개의 I.nil 개체를 보여줍니다. 왼쪽은 크리스퍼 - 카스9에 의해 절단 부위가 절단되었으나, 그 뒤 이식 혹은 삭제된 염기가 없는 I.nil이며, 오른쪽은 두 대립 형질 다 돌연변이가 생긴 I.nil입니다. 왼쪽은 자연 상태의 I.nil처럼 보라색 / 자주색 줄기를 가지고 있지만, 오른쪽은 초록색 줄기를 가지고 있어 두 개체 사이에서 발생한 표현형의 차이를 보여줍니다.

NT is short for Non - Transgenic. The maximum of the insertion of nucleotides by NHEJ is 1bp, and the deletion has a range of 2 ~ 98bp. #9-1, #39-1 are biallelic mutants and #8-1, #36-2 are monoallelic (One allele has the mutation) mutants.

NT는 Non - Transgenic의 약자로, 크리스퍼 - 카스9에 의해 절단 부위가 절단되었으나, 그 뒤 이식 혹은 삭제된 염기가 없는 상태를 뜻합니다. NHEJ에 의해 이식된 염기의 최대값은 1bp이며, 삭제된 염기는 2~98bp까지 있는 것으로 나타났습니다. 위 이미지의 #9-1, #39-1은 두 대립 형질 다 돌연변이가 생겼으며, #8-1, #36-2는 한 대립 형질은 돌연변이이고 다른 것은 정상인 것으로 나타났습니다.

                                                                                               

In the image above, you can see three half - ovals that has the letters L1, L2, L3 on them. This is called a meristem. A meristem is a tissue in plants containing undifferentiated cells. They are found in places where plant growth can take place. Each domain where the letters take place are the layers of the meristem. The L1 layer controls most of the flower petal color. The L2 layer controls the stem color and also slightly contributes to the petal color. The L3 layer forms tissues of roots and others. Since the L2 layer slightly contributes to the petal color, #36-2 has a slight shade of purple for the petal color despite having mutations in the L1 layer.

Professor Ono's team concluded the monoallelic mutants #8-1 and #36-2 to be a L2 periclinal chimera and a L1 periclinal chimera respectively. Periclinal means having one component/tissue completely surrounded by the other component/tissue. In genetics, a chimera (Or chimaera) is an organism having two or more sets of DNA and therefore having multiple genotypic traits in one organism. The conclusion makes sense because the two monoallelic mutants are chimeras where the L3 layer is completely surrounded by the L2 layer which is completely surrounded by the L1 layer. 

위 이미지에서 L1, L2, L3가 적혀있는 반 - 타원이 보이실텐데, 이는 분열조직이라 합니다. 분열조직은 아직 분화되지 않은 세포들로 이루어져 있는 조직으로, 세포 분열 및 분화를 하여 식물을 성장하게 합니다. 글자들이 적혀있는 각 구간들은 분열조직의 층입니다. L1층은 꽃잎의 색의 대부분을 조절하고, L2층은 줄기 색을 조절하며, 꽃잎의 색에 조금 관여합니다. L3층은 뿌리 등의 기관들의 조직을 형성합니다. L2층이 꽃잎 색깔에 관여를 하기 때문에 #36-2는 꽃잎의 색이 L1층에 흰색을 띠게 하는 돌연변이를 가진 세포들만 있는데도 불구하고 L2층이 보라색을 띠게 하는 정상 세포들을 가지고 있어 연한 보라색을 띠게 된 것입니다.

오노 박사님의 연구팀은 #8-1과 #36-2를 L2 둘러쌈 키메라, L1 둘러쌈 키메라임을 결론지었습니다. 키메라는 여러가지 유전형을 가진 하나의 생물을 뜻하는 단어입니다. #8-1과 #36-2는 L3층이 L2층에 의해 완전히 둘러싸여 있고 또 L2층이 L1층에 의해 완전히 둘러싸여 있는 구조를 가진 키메라라서 이 결론이 맞다는 것을 알 수 있습니다.

The periclinal mutants #8-1, #36-2 bore sectorial flowers that were part white only once in their lifetime. The team thought of two potential reasons for the causation of this phenomenon. The first reason is somaclonal mutations/variations. Somaclonal variation is the variation seen in plants that are produced by plant tissue culture (Techniques used to maintain or grow plant cells and tissues).

The second reason is "Invasion of cells from an adjacent layer". I approached this sentence's meaning as "Cells from layers close to each other in one individual organism like the L1 and L2 layer somehow found a way to 'invade' the other layer and differentiated in that layer. Resulting in white sectorial parts in the flower petals". The white sectors were analyzed and were confirmed to be biallelic. It is interesting how this phenomenon happens only once during the organism's lifetime.

둘러쌈 돌연변이인 #8-1, #36-2는 생애에 딱 한번만 꽃잎에 부채꼴 모양으로 하얀색 부분이 나타나는 것이 관찰되었습니다. 연구팀은 이 현상에 대한 잠재적 이유를 두 가지 냈습니다. 첫 번째 이유는 체세포영양계 변이 때문입니다. 체세포영양계 변이는 식물조직 배양에 의해 나타나는 변이입니다.

두 번째 이유는 "인접한 세포들의 침입" 때문입니다. 저는 이 문장의 의미를 "L1, L2층처럼 하나의 생물 내 인접한 층들 사이 세포들이 상대 층으로 들어가 그 층에서 분화를 해 흰색 부채꼴 모양의 꽃잎이 보이게 했다" 로 이해했습니다. 그 흰색 부분들을 분석한 결과, 두 대립 형질 다 돌연변이가 있는 것으로 드러났습니다. 이 현상은 개체의 생애에 딱 한번만 일어난다는 점이 매우 흥미로웠습니다. 

                                                                       

My explanation ends here. I hope what I wrote helped other students to learn and understand science better.

제 설명은 여기까지입니다. 제가 쓴 내용이 다른 학생들이 과학을 배우고 이해하는데에 도움이 되었으면 합니다.

                                                              

                                                             < 10/17, 2017 >

                                                                Haein Kim

                                                                   김해인

Research paper (해당 논문): https://www.nature.com/articles/s41598-017-10715-1

Images from the Research paper.

First Ipomoea nil image from wikipedia(나팔꽃 이미지): https://en.wikipedia.org/wiki/Ipomoea_nil

Sites that helped me to understand the research paper better:

도움이 된 사이트들:

• About Chimeras: https://www.britannica.com/topic/chimera-genetics 
• About Gel electrophoresis: https://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophoresis
• About NHEJ: https://en.wikipedia.org/wiki/Non-homologous_end_joining
• About Exons: https://en.wikipedia.org/wiki/Exon
• About Somaclonal variations: https://en.wikipedia.org/wiki/Somaclonal_variation
• About Plant tissue culture: https://en.wikipedia.org/wiki/Plant_tissue_culture
• About Null mutations: http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/null+mutation
• About Meristems: https://en.wikipedia.org/wiki/Meristem